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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化遮盖组学、LC-MS/MS磷碱化位点数据分析技术服务。
英语翻译副标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文字幕问题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
顾客公司：山东大学
研究探讨食材：拟南芥侧根
拜谱能提供水平：磷过酸遮盖组学、LC-MS/MS磷过酸位点分析一下
分析思绪：
PART 01 探讨毕竟
01、发展素带动VIK的磷碱化还有转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用蛋白酶质成分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 繁殖素驱动VIK的磷碱化举例说明转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷硝化作用实验性。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母菌双改良品种剖析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶专一性影像实验所（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且离体磷过酸实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。随时化学发光法PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素信息主动性控制 LR 健康
利用具体分析的两个VIK T-DNA加入转变体（vik-2和vik-3），找到与也是型相对于，转变体的LR导热系数、LR原基（LRP）和已健康成熟的LR明显缩短，特别是是vik-2（图2）。反着的，过呈现VIK的转什么是dna茎叶突出表现出LR导热系数加大。与此同时，在vik-2转变体经验下呈现VIK的转什么是dna茎叶找回了LR健康成熟异常现象。成长素整理实验操作呈现，vik-2转变体对成长素诱发的LR健康成熟发生反应降低，呈现VIK在成长素调空LR健康成熟中利用重中之重用。 
图2 VIK介导的种子发芽素信息径路单向国家宏观调控LR的阴茎发育
03、VIK 与ERF13 确定力学数据交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子荧光相容 （BiFC）和免疫抗体共滤渣实验英文（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13共同效果
04、VIK以正负极馈的模式自我调节ERF13磷硝化作用
通过磷过酸淀粉酶组学研究，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点变化表明显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反两面馈措施磷酸性反应ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应驱动ERF13分解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体之外调查和身体里调查，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸摸拟和磷酸解离转变体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚癌细胞定位手机概述表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷过酸加快了ERF13光降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸调低 LR 的出显
调查进几步初探了VIK国家宏观调控的ERF13光化学降解在侧根（LR）生长发育中的帮助。顺利通过比不一样转基因常绿绿色树木组常绿绿色树木系的LR表型，看见过把你想表答出来方法ERF13促使了LR的导致，在vik突然变化体中这类促使帮助资料，而在过把你想表答出来方法YFP-VIK的环境下这类促使帮助衰弱（图6）。不仅如此，比ERF13的不一样磷过酸模仿和磷酸灭活进化体的过把你想表答出来方法常绿绿色树木系，看见ERF132A-Myc（磷酸灭活）的常绿绿色树木系LR导致减少，而ERF132D-Myc（磷过酸模仿）的常绿绿色树木系LR导致略多。这么多报告单是因为，VIK介导的ERF13磷过酸和光化学降解增进了LR的导致。 
图6 VIK介导的ERF13磷酸性反应增强LR的出現
07、VIK在侧根健康中磷过酸并比较稳定LBD18球蛋白
确认阐述两大VIK T-DNA放什么是人类基因变异体（vik-2和vik-3），知道与野外型对比，什么是人类基因变异体的侧根（LR）体积、LR原基（LRP）和已滋生的LR显著性抑制，尤其是是vik-2（图7）。对立，过抒发VIK的转什么是人类基因茎秆具体表现出LR体积提高。除外，在vik-2什么是人类基因变异体后台下抒发VIK的转什么是人类基因茎秆回到了LR滋生不足。滋生素清理实验所表述，vik-2什么是人类基因变异体对滋生素引导的LR滋生反映下降，表述VIK在滋生素调节LR滋生中起到首要做用。 
图7 VIK 在LR成型期间中之间磷碱化和保持稳定LBD18蛋白酶
PART 02 短文工作小结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷碱化核胆固醇组学讲解筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的生長素警报调高侧根生成
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核蛋白酶质组学、修饰语核蛋白酶质组学、分解代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—较高淬硬层DIA·磷过酸修饰语组，采用创新聚集系统+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现動物子模板10w+、值物子模板5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参考资料文章：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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